Les KORDYLEWSKI Ph.D.

Tekst załączonego artykułu mojego autorstwa zatytułowany: „Complementary replication of Gap Junctions in sheep cardiac Purkinje strands; Evidence for noncomplementarity of particles and pits” stanowi oryginalny manuskrypt przedstawiający wyniki moich obserwacji trójwymiarowej struktury połączeń szczelinowych (Gap Junctions - GJ) obecnych w błonach komórkowych miocytów serca. Oprocz niego załączam również nigdy nie opublikowany obszerny artykuł przeglądowy pt. „Gap Junction ultrastructure controversy resolved in 3D. Pits and particles do not match.”, który szczegółowo opisuje stosowane przeze mnie metody uwidaczniania submikroskopowych struktur w 3D.

Obserwacje te, po zastosowaniu techniki rozłupywania komórek zamrożonych ciekłym azotem (Freeze-Fracture - FF), były produktem ubocznym moich prac badawczych nad ultrastrukturą błon komórkowych miocytów, przeprowadzonych w latach 1982-1995 w pracowni Mikroskopii Elektronowej Zakładu Medycyny Uniwersytetu Chicagowskiego (Department of Medicine of the University of Chicago). Wyniki tych moich badań są przedmiotem serii publikacji (American Journal of Physiology, 245 (6), H992-H997, 1983; Biophysical Journal, 47, 2, 2, 506a, 1985; American Journal of Physiology, 248 (3, Pt. 2), H297-H304, 1985; Developmental Biology, 112 (2), 485-488, 1985; Tissue and Cell, 18 (5), 793-801, 1986; Circulation Research, 73 (1), 135-146, 1993; Journal of Microscopy, 173 (3), 173-81, 1994; Journal of Histochemistry and Cytochemistry, 43 (5), 481-488, 1995), i są szeroko cytowane.

Dla lepszego uwidocznienia cząstek (Particles) w błonach miocytów i ich ilościowego opracowania konsekwentnie stosowałem obrazowanie trójwymiarowe (poprzez wykonywanie setek fotografii przy pomocy transmisyjnego mikroskopu elektronowego wyposażonego w uchylny stolik) i analizowanie takich stereopar. Tę samą metodę 3D stosowałem przy fotografowaniu obszarów błon z widocznym rozłupanym GJ, przy czym na komplementarnych replikach odnajdowałem komplementarne Face E i P, uprzednio przylegające do siebie przed rozłupaniem tego samego Gap Junction (GJ).

Niestety manuskrypt ten nigdy nie został opublikowany. Moje obserwacje i wnioski (wykazujące niekomplementarność dołeczków (Pits) i cząstek (Particles) koneksonów w komplementarnych replikach rozłupywanych błon komórkowych (przeprowadzone na trójwymiarowych obrazach (stereopairs) tych samych obszarów połączeń szczelinowych w replikach Face E i P tego samego GJ) były wówczas obiektem miażdżącej krytyki, jako niezgodne z przyjętym powszechnie podstawowym modelem struktury Gap Junctions (GJ). Ten tradycyjny model, w którym dołeczki (Pits) maja być bliznami w Face E po wyciągniętych z nich w procesie FF cząstkami (particles) widocznymi w Face P, po dziś dzień tak przedstawiany jest nadal w każdym podręczniku Biologii Komórki.

Po zreferowaniu moich wyników na konferencji Biologii Komórki w Baltimore w 1985 roku (Are gap junctional pits and particles complementary structures? Biophysical Journal, 47, 2, 2, 506a, 1985), zostałem odwiedziony od publikowania pełnego tekstu tego kontrowersyjnego artykułu, gdyż zagrożono mi utratą finansowania prowadzonych przeze mnie badań. Wobec tego nie wysłałem tego manuskryptu do publikacji, mimo ze byłem i jestem nadal przekonany, iż moje wnioski obalające przyjęty powszechnie model są właściwe.

Nikt nigdy dotąd nie zastosował użytej przeze mnie oryginalnej porównawczej metody dopasowywania stron Face E i P poprzez nakładanie na siebie trójwymiarowych obrazów replik w komplementarnych obszarach stron P i E wnętrza błony komórkowej w tym samym GJ. Zwykle stosowano jedynie porównywanie „płaskich” pojedynczych zdjęć face E i P, na ogol w obszarach rozmaitych - a nie w tych samych GJ. Stąd wyciągano tradycyjne wnioski, że wypukłe cząstki (Particles) muszą być zawsze w GJ komplementarne z dołeczkami (Pits).

Moje obserwacje polegające na „dopasowywaniu” szczegółów komplementarnych struktur face E i P w replikach błon pochodzących z tych samych obszarów tego samego GJ zaprowadziły do jedynej możliwej interpretacji, iż po nałożeniu trójwymiarowych obrazów Face E i P tego samego Gap Junction dołeczki „pasują” do przestrzeni pomiędzy koneksonami. To jawnie zaprzeczało powszechnie przyjętemu poglądowi, ze w koneksonie dołeczki (Pits) są komplementarne z cząstkami (Particles), jakoby dołeczki (pits) były bliznami w Face E po wyciągniętych z nich cząsteczkach (particles) widocznych po stronie Face P. Według mnie, po stronie E w każdym GJ pomiędzy dołeczkami widoczne są zarysy drugiego zestawu cząstek. Są one połówkami koneksonów rozerwanych wzdłuż błony na pół w wyniku FF, a w replikach ukazują się jako komplementarne z siostrzanym zestawem połówek koneksonów, widocznych jako cząsteczki po stronie Face P. W nałożonych na siebie trójwymiarowych obrazach Face E i P połówki te są wzajemnie zliniowane w swej osi prostopadłej do płaszczyzny błony.

W okresie kiedy dokonałem tej obserwacji, posługiwałem się licznymi dostępnymi mi wówczas prostymi urządzeniami i technikami dla analizy wysokiej rozdzielczości czarno-białych mikrofotografii – elektronogramów (patrz podrozdział Material and Methods). Moje doskonałej jakości zdjęcia obecnie zasługiwałyby aby (dla potwierdzenia wykazanej przeze mnie kontrowersyjnej komplementarności struktur) opracować je bardziej zaawansowanymi metodami komputerowymi. Niestety obecnie ja sam nie jestem w stanie kontynuować tego zadania.

Temat ten uważam za ważny, ponieważ zwraca on uwagę na możliwą rolę przestrzeni pomiędzy koneksonami, gdzie według mnie zlokalizowane są dołeczki (pits). Mimo obszernej literatury na temat samych koneksonów, znaczenie przestrzeni pomiędzy koneksonami jest niedoceniane. Tam przecież muszą być zlokalizowane nieznane siły, które trzymają koneksony razem. Tymczasem wnioski o roli i strukturze koneksonów wysnuwane są zwykle poprzez stosowanie teoretycznych modeli, a nie w wyniku bezpośredniego uwidaczniania ich struktury. Natomiast czynniki utrzymujące pojedyncze koneksony we wspólnym zespole, które zapewne zlokalizowane są w przestrzeniach pomiędzy koneksonami gdzie widoczne sa dołeczki (pits), pozostają niedoceniane.